Dr.赛流式小课堂 | 一文囊括流式补偿的常见问题

什么是流式补偿？

流式细胞仪可以同时检测多个靶标，这是通过用不同荧光染料标记的抗体来实现的。虽然每种荧光染料都被设计为由特定波长的激光激发，并发射出特定波长范围的光，然而不同荧光染料的发射光波长范围会有重叠，这就是光谱重叠（图1）。而流式补偿就是一个在流式细胞分析中，用于校正荧光染料光谱重叠的数学过程，从而消除不同荧光染料发射光谱重叠带来的信号溢出，以确保检测到的信号真实来源于目标荧光团，从而获得准确的多色流式数据。

图 1. 荧光光谱查看器显示的FITC，PE， PerCP-Cy5.5，APC （由左至右）四色组合。 

流式补偿能不能不调？

现在流式实验使用的荧光染料越来越多，光谱重叠越来越复杂，而补偿对于解析这种复杂的数据、从单个细胞中获取准确的多参数信息是不可或缺的。如图2中所呈现的，不做补偿或者没有正确的补偿，看到的数据是失真的，会导致错误的生物学解释和结论。Dr.赛建议Flowers绝大部分情况下流式实验都要进行补偿调节。

图 2. 不同补偿设置对于流式实验结果的影响。

当然，如果能够确定所使用的染料之间没有光谱重叠的话，理论上确实是可以不调节补偿的。所以，Flowers要充分了解流式细胞仪的配置和染料的光谱，选择染料的时候需与仪器配置兼容，可以通过激光器优化选择来减少染料的信号溢漏。

流式补偿调好之后能不能一直用呢？

同一个方案需不需要每次都调？

得到的补偿值是基于特定的电压设置、抗体/染料组合、仪器状态和单染样本等等计算出来的，这些因素中的任何一个发生变化，补偿值就可能发生改变。如果依然沿用旧的补偿设置，很可能导致数据失真。所以，将“每次实验都调节补偿”作为一个必须遵守的标准操作规程，可以避免大部分因补偿不当导致的数据失真。

调节补偿的单染对照如何设置呢？

目前大部分流式细胞仪都支持自动补偿，软件操作因仪器不同而不同。Dr.赛这里主要想给Flowers介绍一下，如何针对补偿准备对照，也就是常说的补偿单染管。流式补偿单染管需要遵循以下几个原则：

1.多色实验时，所有荧光染料必须各自做一个单染管，补偿单染管和样本染色要使用同一管抗体。

2.为了补偿计算准确，补偿单染管最好有明显的阳性群和阴性群，且能够收集到足够的颗粒数量。如果细胞没有明显阳性群或者靶标表达很弱，可以使用流式补偿微球替代细胞制备补偿单染管。

点击图片, 查看流式补偿微球干货知识

3.补偿单染管信号与实验样本信号相比，要一样强或者更强。

4.补偿调节和样本上机时的荧光通道的电压设置必须保持一致。如果样本上机时发现荧光通道的电压需要调整，那么电压调整好后，所有通道补偿需要重新调节。

5. 补偿单染管与样本的制备过程需要保持一致，每一个实验环节都有可能对荧光染料产生影响，从而影响补偿数值。例如，表面染色CD4之后需要固定破膜再染色胞内靶标，作为CD4的单染补偿染色后也需要进行固定破膜操作，从而跟样本保持一致。

流式补偿数值超过100%或者为负值是否正常？

因为补偿是一个数学过程，所以数值超过100%或者为负值都是有可能的。超过100%是比较常见的状况，这提示有可能光谱重叠导致的荧光溢漏比较严重，通过更高的补偿值来减去溢出信号。这也通常能够提醒Flowers流式方案的设计和染料的选择可能需要优化，或者仪器的设置尤其是荧光通道的电压设置需要优化。当然，即便补偿值超过100%，只要调节合适，也是可以的。而补偿值是负值的情况确实是不太常见的，往往提示实验流程中可能存在需要排查的问题，比如阳性群和阴性群存在差异显著的自发荧光，圈门有问题，仪器电压设置问题，串联染料的断裂等等。

哪些染料之间的补偿值比较大，不建议同时使用？

流式实验中荧光染料的光谱重叠往往无法避免，尤其是对于多色流式实验，很多光谱重叠造成的影响可以通过优化配色方案和补偿来减小。但是，确实有些染料，由于光谱重叠过于强，要特别注意这些染料同时使用时的补偿调节。比如，APC与PE-Cy5；BV711，AF700，PE-Cy5.5，PerCP-Cy5.5； AMCyan和FITC等。还有很多染料，光谱极其接近，在传统流式细胞仪上是同一个通道检测的，这些染料是不能同时使用的。比如，FITC和AF488；APC， AF647和eFluor660；eFluor450，BV421和Super Bright 436；PE-eFluor610和PE-CF594；PerCP-Cy5.5和PerCP-eFluor710等。这类染料还有很多，针对自己不熟悉的染料，可以通过荧光光谱查看器和流式染料通道选择指南来了解染料的光谱信息和对应检测通道。

光谱流式细胞仪是不需要进行补偿调节吗？

Dr.赛这里讲的补偿内容都是针对于传统流式细胞仪的。对于光谱流式来说，是不存在补偿的这个概念的，所以光谱流式不需要补偿这种说法也算是正确的。但是，这并不意味着光谱流式会更加的简单，因为光谱流式是需要通过光谱解析（Spectral Unmixing）来进行数据拆解的，而光谱解析也需要单染对照。UltraComp eBeads Spectral Unmixing Beads (货号: U20250) 经过优化于光谱流式细胞术，通过供精确的单光谱解析对照，增强光谱流式细胞术的检测性能。

流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器、抗体试剂到丰富资源的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及赛默飞科学家们的十年如一日技术陪伴，现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。