琼脂糖凝胶电泳实验指南：从原理到操作全解析-赛默飞

琼脂糖凝胶电泳实验指南：从原理到操作全解析-赛默飞

在生物实验室中，琼脂糖凝胶电泳是 DNA 和 RNA 基于片段大小进行分离的常用方法。琼脂糖凝胶基质为多孔结构，可用作核酸分子迁移的筛网。为了尽可能提高 DNA 分离的准确性，需要选择使用高质量的琼脂糖、大小合适的 DNA ladder 和高灵敏度的 DNA 染料。 Thermo Fisher Scientific 可提供多种经优化用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

琼脂糖凝胶用于 DNA 片段的分离和分析。制备凝胶时，需要琼脂糖粉末和电泳缓冲液。赛默飞E-Gel 琼脂糖预制胶是无需电泳缓冲液的琼脂糖凝胶，在琼脂糖基质中嵌入了电极。每个琼脂糖预制胶在包装的透明塑料盒内均包含离子发生系统、pH 平衡系统和 DNA 染料。还包括两个与凝胶和电极接触的离子交换矩阵（ion exchange matrice，以下简称 IEM）。IEM 在整个预制凝胶中提供持续的离子流，从而产生进行电泳所需的持续电场。

E-Gel 预制凝胶电泳系统的三步法实验流程

E-Gel 预制琼脂糖凝胶电泳系统包括电泳设备、用于图像捕获的相机、预制琼脂糖凝胶、Ladder 和上样缓冲液，共同作用以简化核酸电泳实验流程。

三步法实验流程简单又方便：

1.       上样

2.       电泳

3.       分析

电泳过程无需缓冲液即可进行，节省了实验时间，减少了繁琐的操作。

E-Gel 琼脂糖凝胶电泳和成像系统

与常规电泳方法相比，使用E-Gel 预制琼脂糖凝胶电泳系统可实现更快的电泳设置、运行和分析。

以下两种E-Gel核酸电泳系统均具备：

l  直观的用户界面，配备预设的电泳程序

l  内置透射仪，用于实时观察电泳情况

l  高分辨率凝胶成像相机

l  图像存储和联网能力

琼脂糖凝胶电泳实验与技巧

I部分：向DNA样本说再见——常见琼脂糖凝胶电泳错误

1. 使用水代替凝胶缓冲液或电泳缓冲液

琼脂糖凝胶配制和电泳通常使用TAE或TBE缓冲液进行。 如果您使用水进行凝胶配制和跑电泳，您的凝胶将在电泳时很快融化。 TAE、TBE和水都是透明的溶液；因此，在配制时请检查容器的标签。

2. 使用了错误浓度的琼脂糖

DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度为1.0%。浓度越高，小条带的分辨率越高；反之，琼脂糖浓度越低，大分子量条带的分辨率和分离程度越高。 如果使用了错误浓度的琼脂糖凝胶，就很难确定DNA条带的可靠性。 当使用低百分比浓度琼脂糖凝胶时要小心；它们往往较软，更容易破损。

3. 颠倒了电泳槽与电源连接线的方向

这是很容易犯的错误，但是如果你不小心颠倒了电泳槽与电源连接线的方向，结果将会非常令人沮丧。 因为样本会向相反方向移动，而且由于上样孔与凝胶的末端很近，您会丢失所有的样本。 开始您的电泳后确保DNA样本以正确的方向进入凝胶；如果您看到您的条带向错误的方向移动，请颠倒电源线的方向。

II部分： 琼脂糖凝胶中实现更高分辨率的5种方法

1. 什么是适合于您的琼脂糖凝胶电泳的正确缓冲液？

进行DNA琼脂糖凝胶电泳所需的缓冲液类型，主要取决于DNA片段大小和电泳后的应用。 进行琼脂糖凝胶电泳最常见的两种缓冲液是Tris-乙酸EDTA缓冲液（TAE）和Tris-EDTA缓冲液（TBE）。 因为两种缓冲液的pH值都接近中性，所以缓冲液中的DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动。

对于小片段DNA (<1000 bp)，如果没有计划从凝胶中回收DNA，那么推荐使用1x TBE缓冲液。 TBE溶液具有高离子强度和缓冲能力。 TAE缓冲液，结合低电场强度（1–2 V/cm），最适于分离大DNA（12–15 kb）。 TAE缓冲液与琼脂糖相互作用，相比较TBE缓冲液中的琼脂糖凝胶，会产生更低的电渗透，更大的表面孔经，和更低的电场强度，可降低大DNA的smear现象。

2. 为了获得分辨率您需要的DNA上样量是多少？

DNA样本量可以是各种各样的，关键是您正在分离的DNA条带的DNA含量。 最小可能被检测的DNA的量依赖于所使用的染色方法（例如，使用SYBR Safe DNA凝胶染色可以检测出 3 ng的DNA。 一个清晰且界限分明的条带中DNA最大量为100 ng。

3. 凝胶配制如何影响条带分辨率？

推荐的琼脂糖凝胶厚度为3-4 mm；厚度超过5mm的凝胶会产生模糊的条带和更高的染色背景。与此类似，覆盖在电泳装置中凝胶上的电泳缓冲液厚度为3-5mm。 缓冲液太多会降低DNA迁移率并造成条带变形。

梳齿的厚度也很重要，它会显著影响分辨率。 薄梳(1 mm)会给出界限清晰的条带，而厚梳会产生厚条带，导致分辨率降低。 梳齿应充分清洗以去掉可能的残留物，否则可能会在泳道内产生波浪线。 此外，在去除梳齿前要先加入缓冲液，以减少琼脂糖孔附近的撕裂。

4. 凝胶类型影响条带分辨率吗？

根据DNA的应用和大小，琼脂糖类型会影响DNA分辨率。 凝胶强度，凝胶融解温度，和电渗透是选择合适琼脂糖时的重要因素。 Thermo Fisher提供一系列的琼脂糖类型，专为特定片段大小和应用的优化结果而设计。

UltraPure™琼脂糖是具有标准融解温度的多用途琼脂糖，专为常规分离分析而设计。 UltraPure™ 琼脂糖可分离500 bp至23,000 bp范围内DNA和RNA。

UltraPure™琼脂糖1000专为PCR片段和其它短DNA片段提供更高的分辨率的凝胶。 琼脂糖1000更容易操作，因为它具有更强的凝胶结构： 凝胶强度超过1,400 g/cm²。

作为低熔/凝固温度的琼脂糖，UltraPure™低熔点琼脂糖被推荐用于快速DNA凝胶提取方案。 此琼脂糖分离范围为50 bp至1,000 bp。

5. 您如何选择琼脂糖凝胶电泳运行环境？

推荐的凝胶电泳装置内的电压是4–10 V/cm（正极和负极之间的距离，不是凝胶长度）。 如果电压太低，迁移率会降低，而且条带会因扩散而变宽。 如果电压太高，条带分辨率会降低，这主要是由于凝胶过热引起的。

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赛默飞世尔科技（中国）有限公司