胰蛋白酶在细胞解离与培养中的应用-赛默飞

胰蛋白酶在细胞解离与培养中的应用-赛默飞

使用 Gibco 细胞解离试剂来分离贴壁细胞和组织

为了获得合适数量的细胞进行研究，必须先从较大培养物中分离出一组细胞。进入：细胞解离。Gibco 胰蛋白酶和替代细胞解离产品是组织和单层细胞的理想之选。提供多种形式，包括酶促和化学形式，以满足研究人员进行贴壁细胞培养的不同需求。探索以下选择指南，为您的细胞培养类型选择正确的细胞解离试剂。

胰蛋白酶和细胞蛋白酶化

胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，是分离贴壁细胞培养物和单层细胞的标准方法。这种球状胰腺蛋白酶在赖氨酸和精氨酸的 C 端裂解，分解血管粘附蛋白，并可在细胞收获过程中轻易重悬。

赛默飞世尔科技提供猪胰蛋白酶，EDTA 增强胰蛋白酶以及 TrypLE 酶制剂的配方，这是一种温和的胰蛋白酶样酶。为避免计划外的蛋白质降解，必须使用胰蛋白酶抑制剂灭活有机胰蛋白酶。相比之下，合成胰蛋白酶（如 Gibco TrypLE 产品）通过稀释灭活，无需额外的溶液。

注：如果细胞培养基中含胎牛血清（FBS），在胰蛋白酶化之前需要用平衡盐溶液清洗培养物，以确保胰蛋白酶的功能。

胰蛋白酶-EDTA 

EDTA 是一种螯合剂，可提高胰蛋白酶分离贴壁细胞的能力。EDTA 将钙和镁结合成六齿结构，削弱细胞间粘附，增强胰蛋白酶对水解靶向肽键的获取。

Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由经过电子束验证的辐照猪源蛋白酶制成，并经过 PPV、支原体和 PCV 1/2 污染测试。

帮助实现与 TrypLE 试剂的温和细胞解离

Gibco TrypLE 试剂是高度纯化的重组细胞解离酶，可替代猪胰蛋白酶。这些试剂非常适合在含血清和无血清条件下解离贴壁依赖细胞系，无需更改方案即可直接替代胰蛋白酶。TrypLE 试剂对细胞温和，在室温下稳定，无动物源性。

TrypLE 酶是血清添加和不含血清条件的理想选择，是无动物源性胰蛋白酶样酶的答案。这种酶表现出与胰蛋白酶相似的 pH 值活性谱，在精氨酸和赖氨酸处裂解。由于 TrypLE 酶的无动物来源，消除了潜在致病污染物的危害；并经过受控的发酵过程，TrypLE 酶可以在任何规模下供应。

查看比较图：胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA 与 TrypLE 试剂

胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂破坏性地改变胰蛋白酶，使蛋白水解酶与蛋白质结合并消化蛋白质的能力失效。胰蛋白酶抑制剂用于解离后，保护细胞免受胰蛋白酶进一步的蛋白质降解。

注：大豆胰蛋白酶抑制剂也可结合胰凝乳蛋白酶，尽管程度较小。

胰蛋白酶抑制剂比较图

胶原酶

相对温和的胶原酶以通过消化结缔组织的天然三螺旋胶原纤维而起其作用。这些组织通常存在于皮肤、肌腱、血管和骨骼中—因此胶原酶解聚适用于人类肿瘤、小鼠肾脏、人脑和上皮培养物。

从原代组织中进行细胞分离实验产品和步骤：

TrypLE™ 产品

TrypLE™ 产品的配方可直接替代您现有的方案。下列通用步骤可用于去除培养皿中多种细胞系，同时保持细胞完整性。应根据经验确定各系统可采用的优化条件和浓度。

1.       从培养瓶中慢慢倒出培养基。使用不含钙和镁的 5 ml Dulbecco 磷酸缓冲盐溶液 (D-PBS) 來冲洗培养瓶（Gibco 货号 14190）。慢慢倒出 D-PBS。

2.       向培养瓶加入适量（即在 75 cm2 培养瓶中加入 2 ml）且预热的 TrypLE™。摇动容器，以完全覆盖细胞层。

3.       37°C 下孵育直至细胞分离（每 5 分钟观察一次）。轻轻敲打容器以清除细胞。

4.       用 2 至 5 ml 细胞培养生长培养基进行稀释，然后将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。

5.       以 100 × g 离心 5 到 10 分钟。丢弃上清液，用 2 至 5 ml 新鲜生长培养基悬浮细胞沉淀。

胰蛋白酶

1.       去掉多余的组织后，使用无菌手术刀或剪刀，将剩余组织切成 3-4 mm 的小块。将组织块重悬于不含钙和镁的平衡盐溶液中，进行洗涤。待组织块沉降，去除上清液。重复洗涤 2 到 3 次。

2.       将盛有组织块的容器置于冰上，去除残留的上清液。在 不含钙和镁的平衡盐溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 组织加入 1 ml 胰蛋白酶）。

3.       在 4°C 下孵育 6 至 18 小时，以大幅度地增加几乎没有胰蛋白酶活性的酶的渗透率。

4.       慢慢倒出并丢弃组织块中的胰蛋白酶。将组织块以及残留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分钟。

5.       向组织块中加入温热的完全培养基，用移液管上下吹吸轻轻分散组织。如果使用无血清培养基，还要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

6.       通过无菌不锈钢丝网（100 至 200 µm）过滤细胞悬液，分散剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。

胶原酶

1.       使用无菌手术刀或剪刀，将组织切成 3-4 mm 的小块。使用 Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 洗涤组织块数次。

2.       加入胶原酶（50 至 200 单位/ml，溶解在 HBSS 中）。

3.       在 37°C 下孵育 4 至 18 小时。加入 3 mM CaCl2 可增加解离效率。

4.       通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，将分散细胞和组织碎片与较大的组织块分开。如果需要进一步的解聚 ，在组织块中加入新鲜的胶原酶。

5.       通过离心在 HBSS 中洗涤悬液数次。

6.       将细胞沉淀重悬于培养基中。计数和接种细胞，进行培养。

分散酶

1.       使用无菌手术刀或剪刀，将组织切成 3-4 mm 的小块。使用不含钙和镁的平衡盐溶液洗涤组织块数次。

2.       加入分散酶（0.6 至 2.4 单位/ml，溶解在不含钙和镁的平衡盐溶液中）。

3.       在 37°C 下孵育 20 分钟至数小时。

4.       通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，将分散细胞和组织碎片与较大的组织块分开。如果需要进一步 的解聚，在组织块中加入新鲜的分散酶。

5.       通过离心在平衡盐溶液中洗涤悬液数次。

为您的细胞类型选择正确的胶原酶

分散酶

分散酶或中性蛋白酶是多粘芽孢杆菌产生的金属酶。快速、温和的分散酶可用于收获和转移正常的二倍体细胞和细胞系。分散酶可有效分离细胞团块并从完整组织中分裂细胞，对膜完整性或活力几乎没有影响。

非酶细胞解离

Versene 溶液

Versene 溶液是 PBS 中的 EDTA 溶液，可温和、非酶地解离细胞。这种螯合剂将某些细胞类型（如上皮细胞）从血管表面分离以进行悬浮。也可以用作胰蛋白酶消化前的洗涤剂。

非酶细胞解离缓冲液

推荐用于弱贴壁细胞（如上皮细胞），Gibco 细胞解离缓冲液可温和解离并保持表面蛋白完整性。适合的应用包括参与配体结合的细胞、流式细胞和免疫组织化学研究。

无酶细胞解离缓冲液实验方案：

以下是从基质中快速移取各种细胞系同时保持细胞完整性的一种常规程序。此程序并不普遍适用于所有细胞系。应根据经验确定最适合各系统的条件和浓度。 在传代培养时，应定期监测细胞活力。细胞活力应大于 90%。

1.       使用前将所有试剂加热至 37°C。

2.       去除细胞中的生长培养基。

3.       彻底冲洗单层细胞，每个 T75 培养瓶或 100 mm 培养皿使用 5 ml 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS。轻轻摇动培养瓶（或培养皿），使溶液在室温下将细胞洗涤30至60秒。吸出冲洗液并丢弃。

4.       重复步骤3。

5.       每个 T75 培养瓶或 100 mm 培养皿中加入大约 5 ml 细胞解离缓冲液，然后通过在室温下摇动来轻柔地将细胞洗涤1至2分钟。您可以在显微镜下观察解离情况。 吸出溶液并丢弃。

6.       用手掌用力拍打培养瓶或培养皿，使细胞脱落。如果细胞不能快速脱附，则在室温下再放置2至5分钟，再次用手掌用力拍打培养瓶。对于贴壁能力更强的细胞（使用 5 ml 以上的解离缓冲液），可能需要重复此操作。细胞明显脱附后，加入至少 5 ml 完全生长培养基。将细胞重悬于生长培养基中。

赛默飞世尔科技（中国）有限公司