siRNA（小干扰RNA）的选择与设计技巧-赛默飞

预设计的 Invitrogen Silencer siRNA 适用于 RefSeq 数据库中所有人类、小鼠和大鼠基因靶标。这些 siRNA 是利用高效且经广泛测试的算法设计得到，专门用于实现极高效力和特异性的基因沉默。每种 siRNA 均按照最高质量标准进行合成并且提供完整的序列信息。 

此外，当您购买针对相同靶点的三种 Silencer 预设计 siRNA 时，我们保证至少两个 siRNA 会将靶标 mRNA 水平降低 >70%。 

优化设计 = 保证沉默 

Silencer 预设计和验证 siRNA 通过专有算法设计，专门用于实现极高效力和特异性。在近400种内源表达的人转录本沉默实验中，我们测得约1,100种经该算法设计的 siRNA的效率。此研究表明，对于每个 siRNA，超过 80% 的 siRNA 个体表现出 >>70% 的靶标沉默效果。性能数据清楚地证实了 Ambion siRNA 选择过程的成功。 

Silencer 预设计 siRNA 的有效性。此图显示了针对靶向 >300 种内源表达的人基因的808种 Silencer 预设计 siRNA 测得的基因沉默效果分布情况。靶标 mRNA 水平在转染成 HeLa 细胞后48小时通过 qRT-PCR 测定。超过 82% 的 siRNA 均成功沉默 >70% 的靶标。 

经验证的 Silencer siRNA 

针对人靶标的一组 Silencer siRNA 系列已经通过内部的功能测试，经验证，可以将靶标 mRNA 水平至少减少 70%，使我们能够保证这些 Silencer 经验证 siRNA 能够敲低其靶标基因。这些 siRNA 的数据表展示了在测试期间观察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外显子。对于大多数类型，还免费提供完整的序列信息。 

我们在先进机构中合成和纯化各 siRNA 以便满足最高质量标准。作为我们严格的质量控制程序的一部分，每个 RNA 寡核苷酸均由 MALDI-TOF 质谱和/或分析型 HPLC 分析。为了提供质量，Ambion 还通过凝胶电泳评估每个退火的 siRNA，以确认该链正确退火。因此是被纯化并可以直接使用的优质 siRNA 。 

Stealth RNAi siRNA 

Invitrogen Stealth RNAi siRNA 采用下一代 RNAi 化学成分，其特异性以及血清和细胞培养稳定性均高于标准 siRNA。这种化学成分在消除不必要的脱靶效应的同时产生更清晰的结果，实现： 

Stealth RNAi siRNA 采用极严格的质量控制标准制造。每个单链 RNA 寡核苷酸均通过质谱分析，然后退火并提供指定数量的双链。 

Stealth siRNA 下一代化学成分的优点 

有效敲低 

Stealth RNAi siRNA 提供有效敲低效率，以确保靶标基因的沉默。图1显示了 Stealth RNAi 和未修饰 siRNA 之间的沉默比较，Stealth RNAi 具有以下功能保证：倘若您实验的转染效率至少为 80%，对于每种基因，3种试剂中的至少2种将使够实现至少 70% 的转录物敲低。 

图1.使用 Invitrogen Lipofectamine 2000 递送的 siRNA 和 Stealth RNAi siRNA 可减少 A549 细胞中 p53 的表达。相应的对照包括化学成分匹配且碱基对成分类似的随机序列。p53 表达的减少表现为标准化为 GAPDH 的 p53 的表达倍数变化（相对于实时荧光定量 PCR 测量的相应对照品）。 

更高的特异性 

当 siRNA 与非靶向基因足够同源时，会发生脱靶效应，从而使其与预期靶标沉默。Stealth RNAi 可以消除使用传统 siRNA（即使是低浓度）导致的可能存在问题的正义链介导的脱靶效应。这些问题可能是由于未修饰 siRNA 的正义和反义链都能进入 RNAi 通路所引起。但 Stealth RNAi 修饰只允许反义链有效进入 RNAi 通路。这种修饰消除了对正义链脱靶效应的担忧。 

图2. Stealth RNAi siRNA 表现出更高的靶标特异性。 

更好的稳定性 

与传统、未修饰的 siRNA 相比，Stealth RNAi 修饰还能提高稳定性。传统 siRNA 在含核酸酶的血清中随时间降解，因而它们不适合用于动物。 

但是，Stealth RNAi siRNA 可稳定长达72小时（图3），因而成为涉及使用动物模型的项目的更好选择。这种灵活性可以节省数周时间，免却了为动物研究和细胞培养工作开发和测试不同分子的需要。 

图 3. Stealth RNAi siRNA 在血清中比标准 siRNA 更稳定。在 10% 小鼠血清中孵育后0、4、8、24、48、72小时的未修饰 21-mer dsRNA 序列（左图）和相应的 Stealth RNAi siRNA 序列（右图）。孵育样品后，在 Invitrogen Novex 15% TBE-尿素聚丙烯酰胺预制凝胶上分离。 

更低细胞毒性 

使用标准 siRNA 的研究表明，未修饰 siRNA 可以诱导细胞应激反应通路，如可导致生长抑制和细胞毒性的干扰素反应。这使得很难评估观察到的细胞表型是非特异性应激反应还是靶向基因的功能丧失所导致。Stealth RNAi 消除了 PKR/干扰素反应通路的诱导发生，确保 RNAi 实验结果更清晰（图4）。使用 Stealth RNAi 可实现强大的基因敲低而无激活细胞应激反应的风险，细胞应激反应会导致结果难以解释。 

图4. Stealth RNAi siRNA 避免干扰素反应基因的诱导。在送入 A549 细胞后，siRNA 序列诱导多种干扰素基因。siRNA 序列相同的 Stealth RNAi siRNA 型号不会改变干扰素反应基因的表达。 

处理和重悬 

siRNA 试剂的储存和稳定性： 

在 –20°C 以干燥颗粒形式储存，直至使用。一旦重悬，请在 –20°C 下储存并避免与 RNase 接触。在 -20°C 下储存至少一年。 

重悬 siRNA 

根据图表在 DEPC 处理过的水中重悬 siRNA 或 Stealth RNAi 双链，以制备 20 µM 溶液。将缓冲溶液脱水制备 RNA 寡核苷酸。重悬至 20 µM 会将缓冲液复溶为 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、20 mM NaCl 和 1 mM EDTA。 

Stealth RNAi 和 siRNA 转染浓度 

Stealth RNAi siRNA 或 siRNA 双链的转染浓度通过将所用摩尔量除以取决于最终转染体积（即起始培养基体积加转染混合物体积）确定。使用强效 siRNA 时，我们通常通过针对24孔板中的每个孔向 500 µL 培养基（最终浓度 0.8 - 8 nM）中加入 100 µL 转染混合物来转染 0.5 – 5 pmol。要按比例放大，请增加 siRNA 数量使其浓度不变。我们建议使用能够敲低您基因的最低 siRNA 量，以避免任何非特异性或脱靶效应。 

Silencer Select siRNA 

Silencer Select siRNAs具有以下四大优势： 

使用 Silencer Select siRNA 进行靶向基因沉默 

Silencer Select 设计算法 

大多数 siRNA 设计算法给出的siRNAs，仅能以约 80% 的置信度 预测70% 的靶向 mRNA 沉默效率，而无法给出更有效的 siRNAs。许多 RNAi 应用需要的沉默效率高于当前算法提供的效率。因此，我们使用强大的机器学习方法和来自数千个 siRNA 的性能数据来更好地了解 siRNA 的序列、靶标位置和热力学特性及其沉默效率之间的联系。Silencer Select siRNA 设计算法油然而生。 

图 1.Silencer Select siRNA 设计算法显著提高了有效的 siRNA 预测准确度。 Silencer Select siRNA 设计算法用于针对 40 个不同的靶标设计 155 种 siRNAs。在 HeLa 细胞中使用这些 siRNAs 与旧版算法设计的siRNAs 进行平行测试。在转染后 48 小时使用 TaqMan 基因表达检测实验通过 qRT-PCR 测量 mRNA 敲低效果。结果表示为 Silencer Negative Control #1 siRNA 处理的细胞的 mRNA 表达量的百分比。插图显示了≥70% 和≥80% mRNA 敲低效果的 siRNAs 的百分比。 

增强特异性以减少脱靶效应 

序列特异性脱靶效应是 RNAi 实验中出现假阳性结果的主要原因之一。除了 Silencer Select 算法和生物信息学筛选标准提供的效力改进之外，Silencer Select siRNA 还结合了经证实可提高 siRNA 特异性的修饰技术。 

Silencer Select siRNAs 中的化学修饰： 

图 2.Silencer Select siRNA 修饰可减少脱靶效应并产生更可靠的表型数据。53 种不同的 siRNAs，包括以前指出会引发脱靶效应的旧设计，以 30 nM 的浓度将未修饰和 Silencer Select 修饰的 siRNAs 转染到 U2OS 细胞中。48小时后测量有丝分裂和细胞凋亡。数据以阴性对照 siRNA 转染细胞为对比展示。黑色 = 与对照相似的有丝分裂/凋亡水平。绿色 = 下调。红色 = 上调。请注意，修饰未改变 PLK 和 WEE1 siRNAs 的预期有丝分裂和凋亡表型。相反，通过添加 Silencer Select 修饰消除了 10 个未修饰 siRNAs 介导的脱靶凋亡表型。 

图 3.Silencer Select siRNA 修饰可减少差异表达的脱靶基因的数量。三个带有和不带有 Silencer Select 修饰的阴性对照 siRNA 分别以 30 nM 浓度转染到 HeLa 细胞中。在 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 上提取和分析 RNA，共进行三次。y 轴表示差异表达基因的平均数量——与模拟转染样品相比，表达变化≥2 倍的基因。 

高保障的沉默效率 

100 % 保证 – 业内最佳 

在 Thermo Fisher Scientific，我们保证当您购买两个 Invitrogen Silencer Select 预先设计的针对同一靶标的 siRNA 时，这两个 siRNAs 将使靶标 mRNA 沉默 70% 或更多。要获得保证，siRNA 必须在 ≥5 nM 浓度下转染，并且在转染后 48 小时检测 mRNA 水平。 

经过 Silencer Select 验证的 siRNA 

针对人类靶标的一部分 Invitrogen siRNAs 已在内部进行了功能测试，并经验证可将靶标 mRNA 水平降低 70% 或更多，使我们能够保证这些经过 Silencer Select 验证的 siRNAs 将沉默其靶标基因。这些 siRNA 的数据表展示了在测试期间观察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外显子。对于大多数类型，还免费提供完整的序列信息。