2025版《中国药典》解读 | “分子学解码”第二期：实时荧光定量PCR新规解读

2025版《中国药典》解读 | “分子学解码”第二期：实时荧光定量PCR新规解读

分子学解码

实时荧光定量PCR新规

修订解读

随着《中国药典》1001 聚合酶链式反应法修订稿的公示，实时荧光定量 PCR（qPCR）技术正式成为药品质量控制的关键手段之一。

PART 1

新规聚焦：药典第二法实时荧光定量 PCR 核心要求

《中国药典》1001聚合酶链式反应法修订稿首次系统性地引入了第二法：实时荧光定量PCR法（Real-time qPCR），明确了其在药品质量控制中的重要地位，尤其适用于：

●  定性/定量检测： 动/植物源性中药材、饮片、原材料、中间体、原料药、辅料及生物制品中的特定核酸成分。

●  关键应用： 种属鉴定、杂质残留检测、基因表达分析等。

为了确保结果的准确性和可靠性，新规对实时荧光定量PCR法提出了严格的技术要求：

1.仪器要求

●  具备精确的温度控制能力（变性、退火/延伸等步骤）。

●  需配置与检测要求相匹配的荧光激发与信号读取模块（支持染料法或探针法）。

2.试剂要求

●  核心组分：耐热 DNA 聚合酶、缓冲液、dNTP、引物、模板。

● 探针法需荧光标记探针，染料法需合适的荧光染料。

●  试剂需经验证或质量确认（自制、商品化试剂或专用试剂盒），使用过程严防污染。

●  RNA 检测需特别注意无 RNase 环境和快速灭活 RNA 酶。

3.测定法核心流程

●供试品前处理： 按品种要求进行（同第一法常规 PCR）。

●严格的对照设置：

✦ 阳性对照： 含目标片段且与样品类型一致（定量时浓度/拷贝数需确认）。

✦ 加标对照： 加入阳性对照的待测样品，验证回收率。

✦ 阴性对照： 不含目标片段且与样品类型一致。

●模板制备：

✦ DNA 提取质量要求（OD260/OD280: 1.5-2.5； OD260/OD230: 2-3）。

✦ RNA 提取要求更高（OD260/OD280: 1.8-2.1； OD260/OD230 ≥ 1.7），需逆转录成 cDNA。

●引物与探针： 序列按品种/通则规定。

●核酸扩增： 反应体系组成、循环程序需符合规定，探针法需读取延伸后荧光，染料法需进行熔解曲线分析。

● 数据获取： 设定合理的荧光阈值（Ct值）。

● 系统适用性要求：

✦ 标准曲线： 至少 5 个对数级浓度梯度。扩增效率(E%)必须达到 85%-110%（斜率Slope: -3.10 ~ -3.74）。决定系数（R²）**≥ 0.98**。

✦ 对照组： 阳性对照必须为阳性；加标对照回收率 50%-150%；阴性对照应无 Ct 值或 Ct 值不低于最低浓度标准品。

✦ 重复性： 阳性对照及样品复孔的 RSD ≤ 30%。

✦ 熔解曲线（染料法）： 阳性对照及标准品熔解曲线需为单一尖锐峰，待测样品Tm值需符合规定。

✦ 数据分析： 支持定性、绝对定量和相对定量分析（需内参基因归一化）。

4.方法验证要求

● 新方法需进行系统验证，验证指标（专属性、准确度、精密度、线性、范围、检测限等）需与方法用途匹配。

5.实验室环境要求

●  需符合国家生物安全管理要求。

●  严格分区（试剂配制、模板制备、扩增、产物分析），严防交叉污染。

●  推荐参照 CNAS-GL029《基因扩增领域检测实验室认可指南》 等规范进行管理。

总结新规关键点： 高精度温控、稳定荧光检测、严格系统适用性（效率、线性、重复性、熔解曲线）、合规实验室管理是成功实施药典实时荧光定量PCR法的核心要素。

PART 2

赛默飞 QuantStudio：满足药典严苛要求的完整 qPCR 解决方案

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赛默飞QutantStudio qPCR

系统关键特性对比表

PART 3

应用场景：QuantStudio 助力药品全流程质控

● 中药材/饮片种属鉴定： 利用探针法定量特异性 DNA 片段，准确鉴别乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇、川贝母、霍山石斛等，以及猪、牛、羊源性成分。

● 原材料/辅料溯源与污染监控： 检测动植物源性原料真实性，监控微生物污染（如支原体）。

●生物制品宿主残留 DNA 检测： 高灵敏度定量生产过程中残留的宿主细胞 DNA。

● 基因工程药物质量评价： 分析治疗性蛋白的表达水平。

●  方法开发与验证： QuantStudio系列产品的高性能和灵活性是开发和验证符合药典要求的新qPCR方法的可靠平台。

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尾声

我们将对整个药典第四部与分子学相关的内容进行解析，欢迎大家继续关注！

拓展阅读

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