DNase I揭秘：用于DNA操作研究的强力工具-赛默飞

DNase I揭秘：用于DNA操作研究的强力工具-赛默飞

DNase I是什么酶？

DNase I是一种多功能酶，可以非特异性地切割DNA，产生5'端为磷酸基团的二核苷酸、三核苷酸、或寡核苷酸 (1)。它是一种非常强大的DNA操作研究工具，可用于一系列分子生物学应用。

赛默飞提供DNase I溶液

DNase I酶的功能包括：

1.     提取RNA后降解污染DNA

2.     在RT-PCR前或体外转录后纯化RNA

3.     识别与蛋白结合的DNA序列（DNase I足迹法）

4.     避免处理培养细胞时细胞聚集

5.     为DNA序列体外重组反应提供片段库

虽然实验室会经常用到DNase I，但很多研究者仍对DNase I的活性不甚了解。他们可能会有这样的提问：某种来源的DNase I与另一种的单位是一样的吗？钙离子与镁离子是保持DNase I活性所必需的吗？在DNA与RNA杂合链中，DNase I会不会降解DNA？DNase I能100%去除RNA样品中的污染DNA吗？本文将设法回答围绕这一常用酶的一些问题。

更好的单位定义

DNase I的比活性反映的是每单位酶降解双链DNA的能力。以往，比活性通常用库尼茨单位（Kunitz）表示 (2)，一个库尼茨单位是指以鲑鱼精子DNA为底物，在0.1M NaOAc (pH 5.0) 缓冲液的条件下，使反应液每分钟吸光度增加0.001所需要的酶量。然而这种缓冲液与DNase I消化时使用的典型缓冲液条件是不一样的（见右边的“使用DNase I处理RNA样品”）。我们则提供了一种更好的DNase I单位定义，该定义能更好地反映标准条件下DNase I所具有的降解DNA的能力。DNase I活性测定程序使用实时荧光分析法，可以实现快速、定量的测量。

最优消化条件

和许多其他的酶一样，DNase I活性也会受反应缓冲液成分的影响。与人们通常认知的不同，DNase I在含有Mg²⁺但不含Ca²⁺的缓冲液中没有活性 (3)。事实上，有文献证据表明在不含Ca²⁺的缓冲液中DNase I具有少量活性，是由钙离子污染造成的协同激活作用引起的。因此，在缓冲液中加入远小于Mg²⁺水平、但高于Ca²⁺水平的EGTA，可有效抑制DNase I活性1000倍甚至更多。众所周知，Ca²⁺可与DNase I紧密结合，使其活性结构稳定，甚至微摩尔水平的Ca²⁺也可在Mg²⁺存在的情况下有效激活酶的活性反应。

反映缓冲液的离子强度也是影响DNase I活性的一个因素。DNase I在缓冲液中含有Mg2+与Ca2+且不含其他盐的情况下具有最高活性。当标准反应缓冲液成分的盐（NaCl或KCl）浓度从0增加到30mM时，DNase I的活性会降低2倍多 (4)。虽然MAXIscript™、MEGAscript™或其他转录缓冲液中也含有盐，但它们的DNA降解效果依然很好，因为含有远远超过降解DNA模板所需的DNase I量。关于建议的DNase I消化缓冲液信息，请查看侧边栏的“使用DNase I处理RNA样品”。

剪切的特异性

DNase I消化非匀质dsDNA时会得到60%的双核苷酸、25%的三核苷酸和一些寡核苷酸。DNase I最小可消化三个核苷酸的片段。虽然一般认为DNase I切割DNA时是非特异性的剪切，但实际上它更倾向作用于某些序列片段。例如，DNase I更容易作用于小沟区，也更倾向于剪切嘌呤-嘧啶序列。然而，DNase I在作用于非匀质dsDNA时会对四种碱基都进行剪切，且对于某种特定碱基的作用不会大于其它碱基3倍以上。

赛默飞的技术服务部门经常会被问到DNase I是只能剪切双链DNA，还是同样可以降解单链DNA (ssDNA) 以及RNA-DNA 杂交中的DNA。DNase I能够剪切后两种底物，但活性大大低。例如，DNase I剪切ssDNA的比活性是剪切dsDNA的比活性的约500分之一 (4)，在RNA-DNA杂合链中的活性小于作用于dsDNA 时的活性1-2% (5)。特别要指出的是，在使用DNase I时，通常使用远高于所需的浓度值。例如，实验显示，2个单位的DNase I（产品号 AM2222）孵育15分钟后，可以将1µg的100-mer寡核苷酸降解成小于5-mer的寡核苷酸。因此，切割ssDNA和RNA-DNA杂合链的程度会随着检测时的特定条件不同而不同。

去除RNA制备过程中的DNA污染

DNase I较为常见的应用是在制备RNA过程中是通过降解残留的DNA来控制基因组DNA的量（低于10µg/ml），以免其影响后续的RT-PCR。一次DNase I反应所能处理的RNA量取决于DNA污染的程度。进行有机萃取，或使用固相RNA纯化方法时二氧化硅基体过载时，都可能引入DNA；而从某些组织（例如，脾、肾、胸腺）和或转染后的细胞中提取的RNA同样会倾向于存在更高水平的DNA污染。例如，有报告指出，使用Chomcynsk和Sacchi方法 (6) 提取肿瘤里的RNA会含有7%的DNA，若RNA制备达到一定规模时，DNA的量可以达到微克水平 (7)。

DNA的完全去除

要完全去除RNA样品中的每一条DNA链几乎是不可能的。RT-PCR可以从复杂非匀质混合物中扩增单个分子；事实上，RT-PCR非常敏感，在进行40次以上PCR反应循环后，几乎每次反应都会在无逆转录对照反应中产生扩增条带，表明存在DNA污染。因此，选择最优的DNase I消化条件以及合理的RT-PCR循环数非常重要。为了完全降解DNA，应使用侧边栏“使用DNase I处理RNA样品”中所述的缓冲液。此外，不要在RNA浓度过高时进行消化处理。应先将RNA样品稀释到~100 µg/ml以内后再进行处理。DNase I的用量取决于污染的程度。（相关指示请同样参考侧边栏说明）。

不要浪费DNase！

DNase I是一种粘性酶。添加DNase后十分钟内，我们在某些微量离心管和96孔板上检测到的DNase活性达到所添加的DNase的活性的一半。为了得到更好的实验结果，可使用赛默飞的无粘性不含RNase的微量离心管（产品号12450）用于DNase I消化。

反应后DNase I的去除

‘DNase I处理比较简单，难的是反应后DNase I的去除，而且如果反应后的RNA 是用来合成cDNA的话，去除DNase I就变得更为关键。虽然可用萃取法去除DNase I，但许多研究人员都避免使用这种方法，因为他们担心萃取过程中可能会丢失珍贵的RNA样品，而且萃取法耗时，本身是有毒化学品，另外即使很少的残留也会对cDNA合成产生抑制效果。许多研究人员采用在75摄氏度下加热十分钟的方法使DNase I失活，然而这种方法也会造成RNA 样品的损坏，因为在含有二价阳离子的DNase消化缓冲液中，进行加热时可能造成RNA非酶促降解。DNA-free™（产品号1906）不仅含有DNase I和优化的DNase I缓冲液，还包含一种新颖的DNase去除试剂。该DNase去除试剂在消化完成后加入反应体系时，会与DNase I结合且螯合阳离子，在数分钟内使DNase失活。只需离心去除DNase去除试剂生成的沉淀，就可继续后面的试验了。

截取自Ambion的技术说明稿8:4，© 2001

使用DNase I处理RNA样品：本方法可有效除去25-100ul RNA样品中最多1µg的DNA杂质。首次使用，我们建议25-100ul反应体系中每10µg以内的RNA样品添加2个单位的DNase I*。DNase I缓冲液的配方见下文。如果处理多于10µg的RNA样品，或RNA样品被DNA严重污染 (>10 µg/ml)，应先稀释RNA 样品（如下所示），然后按比例决定反应需要量。对于严重污染的RNA样品，在使用DNase I处理前将核酸浓度稀释到100µg/ml，然后加入2~3ul（4~6个单位）的DNase I，在37°C下孵育1小时。

10倍的DNase I缓冲液

100 mM Tris pH 7.5

25 mM MgCl2

5 mM CaCl2

* 一个单位的DNase I的定义为：在37°C温度下，10分钟降解1µg DNA 所需要的DNase I量。

Thermo Scientific DNase I 可去除细胞裂解物中不需要的 DNA，以改善蛋白提取效率。

Thermo Scientific DNase I 的特点：

•降解并去除样品中不需要的 DNA

•裂解单链和双链 DNA

•与 Thermo Scientific Pierce 细胞裂解试剂兼容

•减少细菌裂解物（蛋白提取物）的粘性以方便移取

脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) 是一种单一糖基化多肽，能够降解不需要的单链和双链 DNA。该酶将 DNA 切割为 5'磷酸二核苷酸及小的寡核苷酸片段。通常将 DNase I 加入细胞裂解试剂中以去除由细菌细胞裂解物中 DNA 含量导致的粘性或去除由体外转录产生的 RNA 中的 DNA 模板。此等级的 DNase 足以进行蛋白研究。在任何需要酶切 DNA 的应用中使用无 RNase 的 DNase，其对于避免 RNA 损伤至关重要。

关于 DNase I 使用的一般信息：

•钙离子对于 DNase I 的活性是必需的。痕量 Ca++ 可能以足够高的浓度存在，使 DNase I 具有活性，但是使用 EGTA 或无钙缓冲液可将 DNase I 的活性降低到无法检测到的水平。

•高水平（即，100 mM）的单价离子（如 Na+ 和 K+）将降低 DNase I 活性

•通过加热至 65°C 并维持10 分钟使 DNase I 失活

•Kunitz 单位：1 Kunitz 单位为，在 25°C 条件（0.1M NaOAc，pH 值 5.0）下因降解高度聚合 DNA 使吸光度增加 0.001 A260nm/min/mL 所需的酶量

•降解分析单位：1 单位定义为在 37°C 条件下，在 10 mM Tris·HCl（pH 值 7.5）、50 mM MgCl2、13 mM CaCl2 中，10 分钟内将 1 μg 质粒 DNA 完全降解所需的酶量。

规格：

• 数量：0.5 mL

•浓度：≥2500 单位/mL

• 单位定义：1 单位定义为在 25°C 下，高度聚合 DNA 使 260nm 处吸光度增加 0.001/min/mL 所需的酶量。

• 外观：透明、无色液体，不含不溶性材料

•配方：DNase I，溶剂为 10 mM Tris-HCl（pH 值 7.5）、10 mM CaCl2、10 mM MgCl2

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赛默飞世尔科技（中国）有限公司