TUNEL染色试剂盒测细胞凋亡 -赛默飞

什么是TUNEL试剂盒？ 

在程序性细胞死亡或凋亡的后期，DNA变得高度断裂。这种断裂提供了一个机会，利用末端脱氧核苷酸转移酶催化的dUTP末端标记(TUNEL)反应，将修饰的dUTP连接到受损DNA的3 ' -OH端。然后，可以使用一系列不同的检测策略来检测修饰的dUTP，如BrdUTP或EdUTP。BrdUTP抗体已用于间接检测，而通过偶联生物素或荧光修饰的核苷酸（即生物素-dUTP或荧光素-dUTP）可实现直接检测。“Click点击化学”反应是目前较新且能提高检测灵活性的修饰方法。TUNEL检测已成为广泛使用的原位检测细胞凋亡的方法。 

在本页，您可以找到： 

• 使用Click点击化学链接的TUNEL试剂 

• 用于组织分析的TUNEL试剂 

• 分析培养细胞的TUNEL试剂 

• DNA染料用于可视化染色质缩合 

• TUNEL染色检测细胞凋亡 

使用点击化学Click的TUNEL试剂盒 

Click-iT TUNEL成像检测试剂盒 

传统上，TUNEL试剂盒使用BrdUTP结合DNA，随后通过各种方法进行检测。Thermo Fisher Scientific开发了经改进的TUNEL试剂盒，它使用TdT在断裂DNA的3’-OH末端引入了炔烃修饰的dUTP、EdUTP（图1）。在Invitrogen Click-iT TUNEL检测中，使用Click点击化学方法检测这个合并的核苷酸，点击化学是一种基于铜催化的叠氮化物-炔烃环加成的反应，其高度特异性源于在生物分子、细胞、组织或模型生物中没有类似的叠氮化物和炔烃反应。可以通过荧光或比色的方法来检测合并的EdUTP。 

图 1.在Click-iT TUNEL成像检测试剂盒中提供了Click-iT EdUTP核苷酸结构。 

Click-iT TUNEL成像检测试剂盒的基本步骤如图2所示。处理样品后，通过固定和渗透细胞或组织来保存晚期凋亡细胞，从而降低由于细胞分离和后续操作损失而导致的假阴性。然后通过TdT将EdUTP核苷酸快速合并到断裂DNA中。下一步是偶联染料或生物素叠氮化物，然后添加复染剂。与一步法掺入染料或生物素修饰的核苷酸相比，对于Click-iT TUNEL成像试剂盒，两步法可在两小时或更短时间内的相同条件下检测到更高比例的凋亡细胞（图3）。 

图 2.用Click-iT TUNEL成像试剂盒检测凋亡。 

图 3.比较不同修饰的dUTP检测凋亡细胞的差异。用0.5μM星形孢菌素处理Hela细胞4小时。细胞固定和破膜后，根据Click-iT EdUTP、BrdUTP和另外2种不同荧光素dUTP产品的说明书进行TUNEL成像检测。根据阴性对照计算阳性百分比。使用Thermo Fisher Scientific公司的ArrayScan II进行成像和分析。 

Click-iT Plus TUNEL成像检测试剂盒 

最初的Click-iT TUNEL成像试剂盒依赖于铜的使用，并且我们发现生物分子对铜浓度表现出不同的敏感性。例如，用于催化链接化学反应的高铜浓度会影响荧光蛋白(如GFP)与其他试剂兼容的能力，因为荧光蛋白的荧光会淬灭或使用肌动蛋白特异性化合物鬼笔环肽时表现出结合能力下降。为了克服这些挑战，我们开发了Click-iT Plus TUNEL试剂盒，经优化的铜浓度使荧光蛋白的信号更稳定且提高与鬼笔环肽结合的兼容性，同时促进检测反应。 

用于组织分析的TUNEL试剂 

用于荧光检测的Click-iT Plus TUNEL试剂 

原位凋亡检测的Invitrogen Click-iT Plus TUNEL检测试剂盒可适用于组织切片和粘附细胞。荧光检测试剂盒与GFP或其他荧光蛋白兼容，并可与鬼笔环肽兼容，如图4所示。Click-iT Plus TUNEL试剂盒具有明亮稳定的荧光信号，可与Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647叠氮化物一起使用。 

图 4.Click-iT Plus TUNEL试剂盒可以与多种其他荧光探针共同使用。用DNase I处理在肠肌中表达GFP的转基因小鼠福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织，然后用Alexa Fluor 594染料进行Click-iT Plus TUNEL检测，再用Hoechst 33342染料和Alexa Fluor 647鬼笔环肽染色。（A）用Hoechst 33342染料（蓝色）对细胞核染色，（B）在周围肌肉层中检测到GFP信号（绿色），（C）丝状肌动蛋白用Alexa Fluor 647鬼笔环肽（紫色）染色，以及（D）通过Click-iT Plus TUNEL试剂盒标记Alexa Fluor 594染料（红色）产生的就是TUNEL阳性信号。最后一个图（E）是四个荧光信号叠加而成的图像。 

用于比色检测的Click-iT TUNEL试剂盒 

Invitrogen Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒已经过优化，通过使用生物素叠氮化物和链霉亲和素-过氧化物酶偶联来识别组织中的凋亡细胞，尽管也可以用于粘附细胞。在将EdUTP掺入DNA片段位点后（图5），用生物素叠氮化物标记EdUTP。随后添加链霉素亲和素-过氧化物酶和DAB（过氧化物酶底物），会产生深棕色信号，可通过光学显微镜检测并储存数据。该检测也可与其他比色组织染料共同使用（图6）。 

图5.Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒的检测工作流程。 

图6.用比色Click-iT TUNEL凋亡检测试剂盒标记小鼠组织切片。使用DAB标记标记福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的8μm小鼠胸腺切片，使用Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒检测凋亡细胞（暗褐色细胞核）。随后用曙红Y（粉红色）对组织进行染色，然后用甲基绿（蓝色）进行核复染、脱水，并硬固定在Thermo Scientific Cytoseal 60固定培养基中。使用EVOS FL自动成像系统获得明场图像，20倍物镜。 

分析培养细胞的UNEL试剂盒 

Invitrogen Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像检测试剂盒适用于HSC和成像分析培养的细胞。小量特异性标记基使实验方案变得快速而有效。这个试剂盒用时在2小时内，能高效鉴别细胞群凋亡的细胞。通过选择荧光标记，Click-iT TUNEL检测试剂盒能与表面和细胞内标志物检测同时使用。然而，对于细胞骨架的检测，我们建议您使用一抗来代替鬼笔环肽（图7）。我们也不建议与荧光蛋白联用。我们已经把该试剂盒和各种凋亡诱导试剂（包括星形孢菌素）用HeLa、A549和CHO K1细胞中进行了测试，同时通过抗体检测凋亡标志物（如裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、剪切的半胱天冬酶-3、磷酸化组氨酸2B）进行了多重检测。它也被证明可以有效地检测人MCF-7乳腺癌细胞中siRNA敲低DEC2转录因子而引起的凋亡。 

图7.使用Click-iT TUNEL成像检测试剂盒对晚期凋亡进行检测。用星形孢菌素处理HeLa细胞，然后固定并破膜。进行Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像检测。用激活型caspase-3兔单克隆一抗检测活化的半胱天冬酶-3，并用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG二抗(绿色)标记。用小鼠单克隆抗微管蛋白抗体检测微管蛋白，并用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（橙色）二抗标记。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。浅蓝色代表半胱天冬酶（绿色）、Hoechst（蓝色）和TUNEL（洋红色）信号的叠加。 

用于染色质缩合可视化的DNA染料 

DNA染料为区分凋亡细胞中的缩合提供了最快、最方便的途径。细胞核染色适用于活细胞或固定细胞，我们提供广泛的波长，更好的与其他标记产品共同使用。ReadyProbes试剂在室温下稳定，并为方便即用滴管瓶形式的DNA染料。 

Click-iT™ TUNEL细胞凋亡实验试剂盒 

初代Click-iT™ TUNEL实验试剂盒针对细胞培养样品优化，也可用于组织样品。我们建议对组织样品使用Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection实验试剂盒；用于组织的Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection实验试剂盒的实验方案针对组织样本优化。通过改进方案可以提高TdT酶进入多层细胞组织样品的效果。另外，相比于Click-iT™ Plus TUNEL试剂盒，我们发现初代Click-iT™ TUNEL试剂盒可能会在组织样品出现高度非特异性结合和点状染色。有一个增加组织透过性较好的方法是用蛋白酶K消化然后甲醛中再固定样品以取代去污剂透化作用步骤。Click-iT™ Plus TUNEL试剂盒手册第三部分的组织固定和透化作用方案可用于初代Click-iT™ TUNEL实验处理组织样品。胃蛋白酶和其他的蛋白水解酶同时也可用于提高组织透过性。 

赛默飞提供TUNEL试剂盒产品，请访问官网了解更多产品信息。