赛默飞助力医学研究系列专题——肿瘤研究（三）：肿瘤稀有突变检测，突破Sanger测序瓶颈

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使用毛细管测序仪、Minor Variant Finder软件检测低频突变

序言

使用下一代测序仪和数字PCR进行低频突变基因的筛选和检测，在临床领域的应用受到越来越多的关注。通过超多重PCR扩增技术和新—代测序仪的Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2，仅使用10ng DNA即可—次筛查约2800种突变，通过正常读取数据和突变读取数据直接比对，可以计算突变率。另— 方面，使用经典Sanger测序时，难以检测出低于25%的低频突变。而本篇文章中介绍的Applied biosystems™ Minor Variant Finder软件，可通过毛细管测序仪，检测出低至5%的低频突变。同时，为了验证该软件所检测的突变，同时结合数字PCR (dPCR)方法加以验证。而且，在千叶县癌症中心临床染色体组研究部横井佐奈部长的大力协助下，我们还尝试使用临床样本，检测EGFR基因的低频突变。

MVF软件中搭载依托Applied Biosystems长期使用并被公认的测序算法。通过最大程度扣除背景噪音信号，可通过对照样本中区分出背景噪声，目视检测出突变峰值。从而检测出过去难以识别的，低至5%突变的峰值。而且，该软件可读取新一代测序仪的vcf文件，从而比对新一代测序仪和毛细管测序仪的结果，并对检测到的突变加以注解。不仅如此，无需更改以往的实验流程即可使用新型MVF软件。使用毛细管测序仪的检测文件(.ab1文件)，分析更简单。

方法及材料 

为验证突变，使用人工基因合成服务lnvitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments，人工合成包括人体EGFR Exon21区域在内的600bp的DNA (图4)。合成含有野生型和突变型两种基因 (COSMIC 6213)的样本， 分别混合成突变型比例为2.5%、5%、10%、20%、50% 的样本。使用Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，样品量6ng,  正向引物及反向引物3.2pmol 的条件下，进行循环测序反应 。使用Applied Biosystems™ BigDye™ XTerminator™纯化试剂盒纯化后，在Applied Biosystems™ 3500xL基因分析仪上，使用POP-7™聚合物、50cm毛细管阵列进行电泳。MVF软件处理所得数据，检测突变。

2. 数字PCR

使用Applied Biosystems™ QuantStudio™3D数字PCR系统，验证dPCR方法的突变频率。把同—样本进行倍比稀释，得到104份重复样品，使用QuantStudio 3D预混液及Applied Biosystems™ TaqMan™SNP基因分型检测体系(检测ID:C_172767645_10)，进行反应。

结果分析 

这次的实验中，可以检测出包括2.5%这种极低频率在内的所有突变，无任何假阴性。

另—方面，5个样本中共计检测出11个突变峰值，其中有6处判定为假阳性。其突变率低至百分之几，且在正向结果和反向结果中超过几倍的差异，其原始数据在该位置噪音较大(图6)。MVF软件可以直接根据各自的峰值，并做出判断，所以可以成为偏离正向和反向的突变率及原始数据噪音大小的判断依据。

在千叶县癌症中心临床染色体组研究部横井佐奈部长的大力协助下，对人体样本也进行了相同的突变检测。结果显示MVF也可检测出人体DNA样本的突变。